冷冻联合免疫疗法治疗小鼠B16黑素瘤
作者：张叔人 张保宁 周春霞 曲平 袁兴华 高峰 李景敏 关秋平 张友会
单位：张保宁 袁兴华 高峰(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院外科)；张叔人 周春霞 曲平 张友会(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所免疫室 北京100021)；李景敏 关秋平(中国民用航空总医院)
关键词：免疫治疗；冷冻疗法；肿瘤细胞，培养的
肿瘤000406 摘要：目的 探讨冷冻治疗附加免疫治疗可能获得更好的抗肿瘤疗效。方法 B16黑素瘤皮下接种C57BL/6小鼠，待肿瘤长至3 mm～5 mm时荷瘤鼠分为四组。1冷冻免疫组：第0天，用深部冷冻治疗仪治疗荷瘤鼠1次。冷冻治疗前2天每只小鼠腹腔注射1 mg环磷酰胺1次，肿瘤局部每天注射IFN-α 5万单位，共2天。从第0天至第10天，每天给小鼠注射1万单位 rIL-2。2、3、4组分别为冷冻治疗组、免疫治疗组和未治疗对照组。根据肿瘤大小和存活时间评价疗效。用3H-TdR释放法测定脾细胞的细胞毒活性。结果 肿瘤接种后第31天，仅第1组肿瘤平均大小与对照组相比有显著差异(P<0.01)。各组平均存活期依次为68.7、55.3、51.6和41天。肿瘤完全缓解率组1为43.8%，组2为11.8 %，而其他两组无1例缓解。组1治愈小鼠用B16再次攻击均未产生肿瘤。组1小鼠脾细胞体外细胞毒实验按效靶比为50∶1时，对B16的杀伤率为42.1 %，对EL4杀伤仅为3.5%。结论 用IFN-α和rIL-2免疫治疗协同冷冻治疗可能通过诱发全身性、特异性抗肿瘤免疫反应，获得更好的疗效。
, 百拇医药
中图分类号：R73-36 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0255-03
COMBINED CRYOTHERAPY AND IMMUNOTHERAPY FOR MOUSE B16 MELANOMA
ZHANG Shu-ren
(Cancer Institute, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College Beijing 100021,P.R.China)
ZHANG Bao-ning
(Cancer Institute, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College Beijing 100021,P.R.China)
, 百拇医药
ZHOU Chun-xia,et al.
(Cancer Institute, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College Beijing 100021,P.R.China)
Abstract：Objective To study if cryotherapy combined with immunotherapy could achieve better therapeutic effect than either used alone. Methods C57BL/6 mice were inoculated subcutaneously with B16 melanoma. When the tumor grew to 3 mm～5 mm in diameter, the tumor-bearing mice were divided into 4 groups. 1. Cryo-immunotherapy group: On day 0, the mice were treated once by deep freezer. Immunotherapy started from day-2， mice received by ip injection of 1 mg cyclophosphamide and peritumoral injection of rIFN-α(5×103 U)，for 2 days. On day 0 to day 10, mice were daily injected with rIL-2(104 U).Group 2,3 and 4 was Cryotherapy, Immunotherapy and Untreated control respectively. The therapeutic effect was assessed by tumor size and survival time. Cytotoxicity of spleen cells was examined by 3H-TdR-release assay.Results On day 31, the average tumor size of mice only in group 1 showed a statistically significant difference (P<0.01) with that in the control mice. The average surviving time of the 4 groups of mice was 68.7, 55.3,51.6 and 41.0 days respectively. Complete tumor regression was observed in 43.8 % of grup 1 mice and 11.8 % of group 2 mice, but none in other two groups. Mice in group 1 with their tumor regressed were rechallenged with B16 cells, but no tumor growth occurred. In vitro cytotoxicity of spleen cells from group 1 mice was 42.1 % against B16 cells and 3.5 % against EL-4 cells (E∶T ratio=50).Conclusion Immunotherapy with IL-2 and IFN-α synergies with cryotherapy possibly enhance a systemic, specific anti-tumor immune response.
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Key words： Immunotherapy； Cryotherapy； Tumor cells, cultured
冷冻疗法治疗肿瘤已有数十年的历史，随着设备的改进，疗效也在不断提高。目前仍作为肿瘤治疗的辅助手段，尤其对于失去手术机会、难以切除的肿瘤，冷冻疗法可作为一种治疗的选择。冷冻可使肿瘤产生凝固性坏死，同时诱导抗肿瘤免疫。然而，诱导这种抗肿瘤免疫作用非常有限。在围冷冻治疗期，结合免疫治疗，对于清除残余肿瘤、防止复发转移可能具有重要作用。本文对冷冻疗法联合免疫治疗的方法进行了研究。
材料与方法
1.实验材料 C57BL/6小鼠由中国医学科学院实验动物中心提供。非免疫原性小鼠黑素瘤细胞株B16和淋巴瘤细胞株EL4均来源于C57BL/6小鼠，引自美国国家癌症研究所。rIL-2北京四环制药厂；rIFN-α美国先灵荷雅公司；环磷酰胺上海华联制药有限公司。
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2.冷冻免疫治疗方法 1×105 B16细胞接种于C57BL/6小鼠侧腹壁。肿瘤直径达3 mm～5 mm时，1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，瘤旁切开皮肤，用LCS300深部冷冻治疗机小号探头接触肿瘤进行冷冻治疗，瘤区形成冰球为止。免疫冷冻联合治疗组(简称联合治疗组)于冷冻前2天腹腔注射1 mg环磷酰胺1次，肿瘤局部注射5万单位IFN-α2次，自冷冻当天起连续10日注射rIL-2，每次1万单位，肿瘤局部与腹腔交替注射；同时设立冷冻治疗组、免疫治疗组(方法同上)和生理盐水对照组，记录肿瘤最大径和垂直径。肿瘤体积=长径×短径2×π/6。
3.肿瘤再攻击实验 将免疫冷冻联合治疗组治愈的小鼠，用1×105 B16再次攻击，同期接种正常小鼠做对照，观察肿瘤是否生长。
4.CTL细胞毒实验 取免疫冷冻组小鼠脾细胞，制成单细胞悬液，0.75% Tris-NH4Cl裂解红细胞后，与预先用135 μl/ml丝裂霉素C处理2 h的B16细胞进行混合淋巴细胞肿瘤细胞培养(MLTC)。第5天将各组淋巴细胞，分别按50∶1和25∶1的效应细胞与靶细胞比例与3H-TdR标记的靶细胞B16或EL4于96孔板中共同温育18 h(每组设三个复孔)，细胞收集器收集残存细胞于玻璃纤维滤纸上，干燥后加闪烁液，用液闪仪测cpm值。
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5.统计学处理 采用Student t检验。
结果
1.冷冻疗法联合免疫治疗抗肿瘤疗效
肿瘤接种第31天(见图1)，联合治疗、冷冻治疗、免疫治疗及对照组各组平均肿瘤大小分别为0.27、1.00、1.16和2.95cm3。联合治疗组与对照组相比显著抑制了肿瘤生长(P<0.01)。单纯冷冻治疗和单纯免疫治疗尽管也抑制了肿瘤生长，但是，与对照组相比无显著差异(P>0.05)。肿瘤接种后第90天计算平均存活期分别为68.7、55.3、51.6和41天(见表1)。联合治疗组治愈率为43.8%(6/14)，单纯冷冻组为11.8%(2/17)，免疫治疗和对照组均为0%。将联合治疗组治愈小鼠用B16再次攻击均未产生肿瘤，而同期接种的正常小鼠于10天内肿瘤均大于0.5 cm3。
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图1 肿瘤接种第31天各组肿瘤大小
表1 荷瘤鼠平均存活天数 组
两次实验存活天数
±s
动物数量
t检验*
生理盐水
41.0±9.1
14
冷冻
55.3±10.5
17
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P<0.05
免疫
51.6±1.7
13
P>0.05
冷冻+免疫
68.7±3
14
P<0.05
*生理盐水组为对照
2.细胞毒实验
效靶比为50∶1时，联合治疗组对B16的杀伤率为42.1 %，对EL4杀伤为3.5 %(见图2)；效靶比为25∶1时，杀伤率分别为31.6 %和4 %，统计学处理均有显著差异(P<0.01)。表明联合治疗可诱导特异性抗肿瘤免疫。
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图2 冷冻联合免疫治疗肿瘤后脾细胞CTL活性
讨论
国际上冷冻外科治疗肿瘤已有了长足的发展，但是疗效仍有限。冷冻外科与普通外科有许多相似之处，又各具特色。它们都可以将大的肿瘤组织清除，而对于亚临床病灶，普通外科则无能为力，而冷冻外科对某些肿瘤宿主可诱发抗肿瘤免疫，但是，其作用极其微弱。而将冷冻和免疫疗法有机结合治疗肿瘤的研究极为少见[1，2]。冷冻可使肿瘤产生凝固性坏死，而肿瘤抗原并没遭受破坏，此时调动和活化机体的免疫系统，诱导特异性抗肿瘤免疫，将会获得更好的疗效。本研究工作即证实了这一点，主要是采用环磷酰胺去除抑制性T细胞；IFN-α增强主要组织相容性复合物Ⅰ类分子的表达，增强抗原呈递作用；IL-2促进T细胞扩增，提高T细胞和NK细胞杀伤肿瘤的作用。其结果最显著的是提高了肿瘤的治愈率。免疫冷冻联合疗法为肿瘤的治疗，防止复发和转移开拓了一条新途径。
基金项目：本文为中国医学科学院基金资助课题
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作者简介：张叔人，男，研究员，博士生导师。
参考文献
[1]Hanawa S. An experimental study on the induction of antitumor immunological activity after cryosurgery for liver carcinoma, and the effect of concomitant immunotherapy with OK432〔J〕. Nippon Geka Gakkai Zasshi, 1993,94(1):57
[2]McCalla Tl, Moore CP, Collier LL. Immunotherapy of periocular squamous cell carcinoma with metastasis in a pony〔J〕. J Am Vet Med Assoc, 1992,200(11):1678
(收稿日期：1999-10-15；修回日期：2000-01-18), 百拇医药
单位：张保宁 袁兴华 高峰(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院外科)；张叔人 周春霞 曲平 张友会(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所免疫室 北京100021)；李景敏 关秋平(中国民用航空总医院)
关键词：免疫治疗；冷冻疗法；肿瘤细胞，培养的
肿瘤000406 摘要：目的 探讨冷冻治疗附加免疫治疗可能获得更好的抗肿瘤疗效。方法 B16黑素瘤皮下接种C57BL/6小鼠，待肿瘤长至3 mm～5 mm时荷瘤鼠分为四组。1冷冻免疫组：第0天，用深部冷冻治疗仪治疗荷瘤鼠1次。冷冻治疗前2天每只小鼠腹腔注射1 mg环磷酰胺1次，肿瘤局部每天注射IFN-α 5万单位，共2天。从第0天至第10天，每天给小鼠注射1万单位 rIL-2。2、3、4组分别为冷冻治疗组、免疫治疗组和未治疗对照组。根据肿瘤大小和存活时间评价疗效。用3H-TdR释放法测定脾细胞的细胞毒活性。结果 肿瘤接种后第31天，仅第1组肿瘤平均大小与对照组相比有显著差异(P<0.01)。各组平均存活期依次为68.7、55.3、51.6和41天。肿瘤完全缓解率组1为43.8%，组2为11.8 %，而其他两组无1例缓解。组1治愈小鼠用B16再次攻击均未产生肿瘤。组1小鼠脾细胞体外细胞毒实验按效靶比为50∶1时，对B16的杀伤率为42.1 %，对EL4杀伤仅为3.5%。结论 用IFN-α和rIL-2免疫治疗协同冷冻治疗可能通过诱发全身性、特异性抗肿瘤免疫反应，获得更好的疗效。
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中图分类号：R73-36 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0255-03
COMBINED CRYOTHERAPY AND IMMUNOTHERAPY FOR MOUSE B16 MELANOMA
ZHANG Shu-ren
(Cancer Institute, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College Beijing 100021,P.R.China)
ZHANG Bao-ning
(Cancer Institute, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College Beijing 100021,P.R.China)
, 百拇医药
ZHOU Chun-xia,et al.
(Cancer Institute, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College Beijing 100021,P.R.China)
Abstract：Objective To study if cryotherapy combined with immunotherapy could achieve better therapeutic effect than either used alone. Methods C57BL/6 mice were inoculated subcutaneously with B16 melanoma. When the tumor grew to 3 mm～5 mm in diameter, the tumor-bearing mice were divided into 4 groups. 1. Cryo-immunotherapy group: On day 0, the mice were treated once by deep freezer. Immunotherapy started from day-2， mice received by ip injection of 1 mg cyclophosphamide and peritumoral injection of rIFN-α(5×103 U)，for 2 days. On day 0 to day 10, mice were daily injected with rIL-2(104 U).Group 2,3 and 4 was Cryotherapy, Immunotherapy and Untreated control respectively. The therapeutic effect was assessed by tumor size and survival time. Cytotoxicity of spleen cells was examined by 3H-TdR-release assay.Results On day 31, the average tumor size of mice only in group 1 showed a statistically significant difference (P<0.01) with that in the control mice. The average surviving time of the 4 groups of mice was 68.7, 55.3,51.6 and 41.0 days respectively. Complete tumor regression was observed in 43.8 % of grup 1 mice and 11.8 % of group 2 mice, but none in other two groups. Mice in group 1 with their tumor regressed were rechallenged with B16 cells, but no tumor growth occurred. In vitro cytotoxicity of spleen cells from group 1 mice was 42.1 % against B16 cells and 3.5 % against EL-4 cells (E∶T ratio=50).Conclusion Immunotherapy with IL-2 and IFN-α synergies with cryotherapy possibly enhance a systemic, specific anti-tumor immune response.
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Key words： Immunotherapy； Cryotherapy； Tumor cells, cultured
冷冻疗法治疗肿瘤已有数十年的历史，随着设备的改进，疗效也在不断提高。目前仍作为肿瘤治疗的辅助手段，尤其对于失去手术机会、难以切除的肿瘤，冷冻疗法可作为一种治疗的选择。冷冻可使肿瘤产生凝固性坏死，同时诱导抗肿瘤免疫。然而，诱导这种抗肿瘤免疫作用非常有限。在围冷冻治疗期，结合免疫治疗，对于清除残余肿瘤、防止复发转移可能具有重要作用。本文对冷冻疗法联合免疫治疗的方法进行了研究。
材料与方法
1.实验材料 C57BL/6小鼠由中国医学科学院实验动物中心提供。非免疫原性小鼠黑素瘤细胞株B16和淋巴瘤细胞株EL4均来源于C57BL/6小鼠，引自美国国家癌症研究所。rIL-2北京四环制药厂；rIFN-α美国先灵荷雅公司；环磷酰胺上海华联制药有限公司。
, 百拇医药
2.冷冻免疫治疗方法 1×105 B16细胞接种于C57BL/6小鼠侧腹壁。肿瘤直径达3 mm～5 mm时，1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，瘤旁切开皮肤，用LCS300深部冷冻治疗机小号探头接触肿瘤进行冷冻治疗，瘤区形成冰球为止。免疫冷冻联合治疗组(简称联合治疗组)于冷冻前2天腹腔注射1 mg环磷酰胺1次，肿瘤局部注射5万单位IFN-α2次，自冷冻当天起连续10日注射rIL-2，每次1万单位，肿瘤局部与腹腔交替注射；同时设立冷冻治疗组、免疫治疗组(方法同上)和生理盐水对照组，记录肿瘤最大径和垂直径。肿瘤体积=长径×短径2×π/6。
3.肿瘤再攻击实验 将免疫冷冻联合治疗组治愈的小鼠，用1×105 B16再次攻击，同期接种正常小鼠做对照，观察肿瘤是否生长。
4.CTL细胞毒实验 取免疫冷冻组小鼠脾细胞，制成单细胞悬液，0.75% Tris-NH4Cl裂解红细胞后，与预先用135 μl/ml丝裂霉素C处理2 h的B16细胞进行混合淋巴细胞肿瘤细胞培养(MLTC)。第5天将各组淋巴细胞，分别按50∶1和25∶1的效应细胞与靶细胞比例与3H-TdR标记的靶细胞B16或EL4于96孔板中共同温育18 h(每组设三个复孔)，细胞收集器收集残存细胞于玻璃纤维滤纸上，干燥后加闪烁液，用液闪仪测cpm值。
, http://www.100md.com
5.统计学处理 采用Student t检验。
结果
1.冷冻疗法联合免疫治疗抗肿瘤疗效
肿瘤接种第31天(见图1)，联合治疗、冷冻治疗、免疫治疗及对照组各组平均肿瘤大小分别为0.27、1.00、1.16和2.95cm3。联合治疗组与对照组相比显著抑制了肿瘤生长(P<0.01)。单纯冷冻治疗和单纯免疫治疗尽管也抑制了肿瘤生长，但是，与对照组相比无显著差异(P>0.05)。肿瘤接种后第90天计算平均存活期分别为68.7、55.3、51.6和41天(见表1)。联合治疗组治愈率为43.8%(6/14)，单纯冷冻组为11.8%(2/17)，免疫治疗和对照组均为0%。将联合治疗组治愈小鼠用B16再次攻击均未产生肿瘤，而同期接种的正常小鼠于10天内肿瘤均大于0.5 cm3。
, http://www.100md.com
图1 肿瘤接种第31天各组肿瘤大小
表1 荷瘤鼠平均存活天数 组
两次实验存活天数
±s动物数量
t检验*
生理盐水
41.0±9.1
14
冷冻
55.3±10.5
17
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P<0.05
免疫
51.6±1.7
13
P>0.05
冷冻+免疫
68.7±3
14
P<0.05
*生理盐水组为对照
2.细胞毒实验
效靶比为50∶1时，联合治疗组对B16的杀伤率为42.1 %，对EL4杀伤为3.5 %(见图2)；效靶比为25∶1时，杀伤率分别为31.6 %和4 %，统计学处理均有显著差异(P<0.01)。表明联合治疗可诱导特异性抗肿瘤免疫。
, 百拇医药
图2 冷冻联合免疫治疗肿瘤后脾细胞CTL活性
讨论
国际上冷冻外科治疗肿瘤已有了长足的发展，但是疗效仍有限。冷冻外科与普通外科有许多相似之处，又各具特色。它们都可以将大的肿瘤组织清除，而对于亚临床病灶，普通外科则无能为力，而冷冻外科对某些肿瘤宿主可诱发抗肿瘤免疫，但是，其作用极其微弱。而将冷冻和免疫疗法有机结合治疗肿瘤的研究极为少见[1，2]。冷冻可使肿瘤产生凝固性坏死，而肿瘤抗原并没遭受破坏，此时调动和活化机体的免疫系统，诱导特异性抗肿瘤免疫，将会获得更好的疗效。本研究工作即证实了这一点，主要是采用环磷酰胺去除抑制性T细胞；IFN-α增强主要组织相容性复合物Ⅰ类分子的表达，增强抗原呈递作用；IL-2促进T细胞扩增，提高T细胞和NK细胞杀伤肿瘤的作用。其结果最显著的是提高了肿瘤的治愈率。免疫冷冻联合疗法为肿瘤的治疗，防止复发和转移开拓了一条新途径。
基金项目：本文为中国医学科学院基金资助课题
, http://www.100md.com
作者简介：张叔人，男，研究员，博士生导师。
参考文献
[1]Hanawa S. An experimental study on the induction of antitumor immunological activity after cryosurgery for liver carcinoma, and the effect of concomitant immunotherapy with OK432〔J〕. Nippon Geka Gakkai Zasshi, 1993,94(1):57
[2]McCalla Tl, Moore CP, Collier LL. Immunotherapy of periocular squamous cell carcinoma with metastasis in a pony〔J〕. J Am Vet Med Assoc, 1992,200(11):1678
(收稿日期：1999-10-15；修回日期：2000-01-18), 百拇医药